Reacción en Cadena de la Polimerasa

Las técnicas de biología molecular están basadas en la manipulación y detección de gran número de moléculas. Dicho con otras palabras, la tecnología actual no permite, en general, el estudio de moléculas aisladas o únicas. Es por ello que uno de los pasos de los proyectos de biología molecular consiste en la amplificación de secuencias de DNA.  La historia del desarrollo de la PCR es ciertamente curiosa. La técnica tuvo tanto impacto en el mundo científico, que en 1993 le fue concedido el Premio Nobel de Química a su inventor “oficial”, Kary B. Mullis, quien describió el proceso en 1985 y 1988. Sin embargo, catorce años antes (1971 y 1974), el Dr. Molineux, del grupo de Khorana, describió la misma técnica con gran detalle, aunque, lamentablemente, consideraron que dicha metodología no era funcional. Desde su “redescubrimiento oficial” en 1985, la PCR se ha consolidado como la técnica clave de la biología molecular actual.

Ya podemos intuir, aun sin conocer los detalles, la importancia del descubrimiento de la PCR: mediante esta técnica es posible generar muchas copias de un fragmento de DNA y distinguirlo del resto del DNA total extraído. A continuación se detallarán los componentes, necesarios para completar la reacción, así como la base teórica de la misma.

Componentes de la PCR

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener

muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este

fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este

resultado, ¿qué es necesario añadir a la reacción?

El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es

decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA

molde.

Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde:

una DNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado

para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como

cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente

en forma de Cloruro de magnesio (MgCl2).

Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son

capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de

DNA. Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de

DNA de cadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers de la

reacción. Como será explicado posteriormente, son los primers los que van a delimitar el fragmento a amplificar.

Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena

complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de

nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena

molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos

trifosfato (dNTPs).

Estos cinco componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a

la reacción para que se complete una PCR.

Base teórica de la PCR

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma:

partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos

complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de

los cebadores al molde. Ahora bien, ¿cómo tiene lugar esta reacción? Como

veremos a continuación los cambios de temperatura constituyen la base para que

se completen los pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases:

desnaturalización, hibridación y elongación:

1.- Desnaturalización del DNA: Ello se consigue elevando la temperatura a aproximadamente 95°C para separar las 2 cadenas que componen la doble hélice de DNA.

2.- Hibridación de primers o iniciadores: Para ello se baja la temperatura de reacción, de manera que pequeñas secuencias de DNA de cadena sencilla ( habitualmente de 15-25 nucleótidos ), se unan a sus secuencias complementarias del DNA molde. Cada uno de ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus extremos 3' -OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a amplificar. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35°C y 60°C 

3.-Elongación: Se consigue elevando la temperatura de la reacción .La enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la

temperatura de elongación suele ser de 72ºC.