Extracción de Acidos nucleicos

Extracción y purificación de los ácidos nucleicos

Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación especifico para ellas. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas.

Cromatografía de penetrabilidad: El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.

Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño.

Cromatografía de intercambio iónico: Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Columnas de polipropileno: La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).

Cromatografía de adsorción: Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA.

Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.

Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc.

Ultrafiltración: En esta tecnología, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los ácidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Después de un paso de lavado opcional, se recuperan los ácidos nucleicos añadiendo agua o un tampón adecuado.

Bolas magnéticas: Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los ácidos nucleicos purificados se eluyen de la solución con las bolas paramagnéticas bajo condiciones de baja salinidad y están listos para ser usados en posteriores aplicaciones.

Pasos generales de la extracción:

Todos los métodos de preparación de las muestras pueden dividirse en una serie de pasos generales, de tal forma que la necesidad de cada paso depende del microorganismo y de la muestra:

Liberación de los ácidos nucleicos de las bacterias, hongos o virus. Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias (Mycoplasma spp.) pero muy difícil en el caso de otras bacterias (Mycobacterium tuberculosis) y hongos.

Hay una gran variedad de métodos para la liberación de los ácidos nucleicos de diferentes microorganismos, entre los que se encuentran el hervir en agua destilada o tampón de PCR, el uso de detergentes con o sin calor, hidróxido sódico con calor, ciclos de congelación-descongelación, SDS-proteinasa K, ácido perclórico, enzimas (lisozima), sonicación, etc. aunque la utilización de enzimas no es muy recomendable ya que la propia muestra puede contener inhibidores de las mismas.

Protección y estabilización de los ácidos nucleicos frente a la degradación. El RNA es mucho más difícil de estabilizar que el DNA.

Eliminación de inhibidores de la amplificación. Para algunas muestras (esputo, sangre) pueden ser necesarios más pasos que para otras (orina, LCR).

Concentración de la muestra y la diana en un pequeño volumen. Algunas muestras (esputo para M.tuberculosis y Legionella pneumophila y sangre para sepsis) requieren una mayor grado de concentración que otras (orina para Chlamydia o Gonococcus) para alcanzar la sensibilidad deseada

Colocación de la diana en un medio acuoso compatible con el método de amplificación: Generalmente se utiliza agua grado biología molecular para la elución de los ácidos nucleicos.